کلون کردن سلول (cloning)
درصدی از سلولهای لاین در اثر پاساژهای مکرر و برخی عوامل شیمیایی دچار موتاسیون می شوند. کلونینگ سلولها جهت جداسازی موتانتهای خاص و استرین های سلولی و در نهایت کاهش هتروجنسیتی Heterogencity در کشت سلولها می باشد.
وسایل و تجهیزات
لامینار فلو، انکوباتور c°37 با دیاکسیدکربن 5% ، میکروسکوپ اینورت، سمپلر 8 کاناله با سرسمپلر 100 میکرو لاندی، لوله آزمایش استریل، پیپت در سایزهای 1،2 و 10 میلی ، میکروپلیت 96 خانه ای، لام نئوبار، ورتکس، میکروتیوپ
مواد
محیط کشت ، سرم جنین گوساله، محلول تریپسین، فلاسک 25 سانتی مترمکعبی حاوی کشت سلول
روش کار
1- داخل هریک از چهار لوله آزمایش 9 سی سی از محیط کشت سلول حاوی 10% سرم جنین گوساله بریزید.
2- مشابه پاساژ سلول فلاسک کشت تریپسینه کرده و توسط پیپت 5 سی سی با محیط کشت سوسپانسیون غلیظی از سلول تهیه کنید.
3- از سوسپانسیون سلول یک سی سی به لوله اول ریخته و توسط ورتکس خوب مخلوط کنید.
4- با استفاده از لام نئوبار از رقت 10/1 برداشته و سلول را شمارش کنید.
5- رقت سازی را ادامه دهید تا به نسبت 20-10 سلول در هر میلی تهیه شود.
6- از آخرین رقت توسط توسط سمپلر داخل هر چاهک میکروپلیت 100 لاندا بریزید.
7- درب میکروپلیت را گذاشته و مدت 3-1 هفته در انکوباتور c°37 قرار دهید.
8- بطور روزانه هر یک از چاهکهای میکروپلیت را توسط میکروسکوپ اینورت و با لنز 10 کنترل نموده و چاهکهایی که دارای یک کلنی از سلول هستند علامت گذاری نمائید.
9- با پر شدن چاهک از کلنی تک آنها را توسط سمپلر 100 لاندایی تریپسینه کرده و داخل چاهک میکروپلیت 25 خانه ای منتقل کنید.
10- بتدریج کشت سلول کلون شده را به داخل فلاسک منتقل کنید و سپس در تانک ازت ذخیره نمایید.
